一、分析项目：检测乳和乳制品中黄曲霉毒素M1
二、分析原理：
高效液相色谱法分离原理是基于混合物中各组分物理化学性质和结构上的差异，使其在流动相和固定相中的分配系数或吸附系数的不同而形成差速迁移，导致各组分分离的技术。
亲和柱内含有黄曲霉毒素M1 特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当试样通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M1 （抗原）集合，形成抗体—抗原复合体。用水洗柱去除柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1收集洗脱液。用带有荧光检测器的高校液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1的含量。
三、仪器条件：
色谱仪：液相色谱仪——荧光检测器
分析柱：C18 250mm*4.6mm,5um
柱温箱：35℃
流动相：乙腈/水=35/65
进样模式：partical loop
进样体积：20ul
进样速度：快速
流速：1ml/min
检测器：激发波长 365nm，发射波长 435nm
分析时间：10分钟
四、试剂
乙腈：色谱纯；
10%乙腈水溶液：100ml乙腈+900ml纯净水，使用前脱气；
流动相：35%乙腈水溶液，350ml乙腈+650ml纯净水，使用前过滤、脱气；
氮气：99.9%高纯氮气；
黄曲霉毒素M1：10ug/ml乙腈溶液，纯度≥98%。
五、前处理设备
固相萃取装置：12孔，含无油真空系统，一套；
M1免疫亲和小柱：一包；
氮吹仪： 12孔，一台；
超声波清洗器：一台；
漩涡混合器：一台；
高速离心机：≥10000转/分钟，一台；
溶剂过滤器：一套；
移液器： 20-200ul一支，100-1000ul一支；
棕色容量瓶：100ml，5个；
离心管： 50ml带刻度，一包；
玻璃纤维滤纸：12mm*75mm，1.5um；（可选）
玻璃漏斗：配合离心管使用，5个；
一次性针管：5ml、 10ml，50ml各一包；
移液管：1ml、2ml、5ml、50ml（带刻度）；
玻璃试管：能用于氮吹仪，体积大约50ml， 20支。
六、标准曲线的制备
1、标准储备液。
黄曲霉毒素M1标准样品：10ug/ml的乙腈溶液1ml。将全部液体转移至100ml棕色容量瓶中，用乙腈定容。浓度为0.1ug/ml。
2、标准工作液。
 黄曲霉毒素M1储备液分别移取不同的体积，置于是试管（体积约50ml）中，用氮吹仪35℃缓缓吹干。
取出吹干的试管，用10%乙腈水溶液20ml溶解，超声，漩涡混合。
用针头过滤器过滤上述溶液，于样品瓶中待测。
用具体说明如下表：
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序号
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标准储备液体积
（ml）
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定容体积
（ml）
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标准工作液浓度（ug/ml）
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进样的绝对含量
（ng）
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1
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0.5
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20
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0.0025
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0.05
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2
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1
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20
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0.005
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0.1
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3
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2
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20
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0.01
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0.2
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4
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4
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20
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0.02
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0.4
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七、样品前处理
1、 样品制备。
液奶。试样装在50ml离心管中，在水浴中加热到35-37℃，取出，采用10000转/分钟离心10-15分钟。取底层溶液（上层为脂肪层，取液时不要搅动脂肪层），用玻璃纤维滤纸过滤，以除去部分大分子，过滤速度很慢。收集50ml液态奶样品，用于下一步操作。
可以直接取底层溶液上免疫亲和小柱净化。
2、M1免疫亲和柱的准备。
将冷藏的M1免疫亲和柱取出，温度缓至室温，保证小柱的活性最佳（或者利用35℃烘箱回复温度）。小柱与固相萃取装置连接，将一次性的50ml针管与小柱顶部连接，按照说明书使用小柱。
3、样品的提取与纯化。
² 上样。将过滤后的50ml样品转移至一次性针管中，调节固相萃取装置旋钮选择合适的上样速度，一般为1-2滴/秒。由于大分子比较多，此过程耗时比较长，一般1-2小时。
² 洗涤。取下50ml针管，换成10ml一次性针管，加入10ml水，以稳定的流速洗涤小柱，一般为自然流出，然后利用真空系统抽干亲和柱。
² 洗脱。除去真空系统，另换一只5ml一次性针管与小柱连接，加入4ml乙腈。缓慢的推动注射器的栓塞，控制洗脱流速，一般为1滴/2秒。收集黄曲霉毒素M1的洗脱液于试管中，洗脱时间一般不少于60秒。
² 浓缩。将收集的洗脱液用氮气缓缓吹至近干，温度为30℃，剩余体积为50-500ul，一般以一滴观察，如果蒸发至干，有可能损失黄曲霉毒素M1，所以尽量至近干。
² 定容。将浓缩后的样品用10倍的水溶解，定容2ml。 用移液器准确移取2ml水定容。
八、上机分析。
注意事项：
1、做加标回收率时，要求定容准确，采用合适的量器定容。
2、小柱使用按照说明，恢复室温条件下使用，控制上样、洗脱流速。
3、浓缩至近干，否则易损失AFM1。
4、所有用过M1的器皿，要用次氯酸钠浸泡。
操作过程注意安全防护，并且尽量避光操作 |
